Теоретические основы работы люминесцентных сенсоров. Хронофлуорометры

21.3.3. Хронофлуорометр "Флоратест-2"

Когда в широкую продажу поступили яркие светодиоды, то появилась возможность и была осуществлена разработка усовершенствованного образца хронофлуорометра. При этом были устранены все недостатки хронофлуорометра "Флоратест-1", выявленные за время исследовательской эксплуатации этих сенсоров:

• сравнительно низкий уровень квантовой интенсивности возбуждающего света в 20...40 мкмоль/(м²с);
• наблюдение флуоресценции только на просвет, что делало невозможным исследование толстых листьев растений;
• инерционность и недостаточная надежность механической шторки;
• ограниченная точность, малая внутренняя память и недостаточная эксплуатационная надежность всего сенсора;
• отсутствие автоматической адаптации сенсора к изменению видов растений, возраста листьев, условий освещения и т.п.

В табл. 21.2 приведены светотехнические параметры ярких и суперярких светодиодов и полупроводниковых лазеров начала ХХІ в., которые излучают нужный в данном случае ("актиничный") сине-голубой свет. Следует также заметить, что диапазон силы света можно регулировать, изменяя силу тока через светодиод.

Таблица 21.2. Светотехнические параметры светодиодов и полупроводниковых лазеров

№ п/п	Тип	Длина волны [ нм ]	Сила света (при 20 ма ) [ миликандел ]	Расчетная мощность [ мВт ]	Телесный угол излучения [ стерадиан ]
1	2	3	4	5	6
1	L0494 PBL 4-BOG	465...475	145...550	0,23...0,58	1,13
2	L0574 PBL 4-BOG	465...475	200...550	0,37...1,02	1,28
3	КИПМ 15Г (Н,Р,Р,С) 30-1С-П1	470	700...3500	0,47...2,35	0,46
4	HLMP–PBxx/HLMP–5Bxx	470	20...270	0,04...0,53	1,355
5	HLMP–ABxx/HLMP-BBxx	472	205	1,46	0,795
6	HLMP-AB01/ AB11/BB01/ BB11	472	400	0,58	0,79
7	КИПД 40Л (М,Н,П,Р,С) 20-1С-П4	475	500...3000	0,26...1,53	0,35
8	NSPB 346 BS	475	200...860	0,37...1,6	1,2
9	NSPB 546 BS	475	300...860	0,58...1,5	1,2
10	HLMP – CB 15	475	630...1575	0,2...0,5	0,22
11	HLMP – CB 30	475	560	0,38	0,46

В портативном хронофлуорометре вполне приемлемо освещать на поверхности листка круг площадью до 20 мм² (диаметр до 5 мм). Чтобы получить квантовую интенсивность 20...500 мкмоль/(м²с), что эквивалентно энергетическому потоку 5...120 Вт/м², на этот круг должен падать световой поток мощностью 0,1...2,4 мВт. В зависимости от вида источника света и от оптической схемы на исследуемый листок растения можно направить от 5 до 80% светового потока, излучаемого источником. Круг площадью 20 мм² на расстоянии 5 мм от светодиода виден под телесным углом 0,8 стерадиана. Расчеты показывают, что эти условия могут быть выполнены с применением нескольких типов светодиодов.

Конструкция выносной оптоэлектронной головки нового поколения хронофлуорометров показана на рис. 21.5.

Рис. 21.5. Конструкция оптоэлектронной головки: 1 – листок растения; 2 – мягкие черные прокладки; 3 – светодиоды; 4 – красный светофильтр; 5 – фотоприемник; 6 – крышка; 7 – диафрагма; 8 и 9 – нижняя и верхняя "щечки"; 10 – ось с пружиной

В головке применена пара ярких светодиодов. Их малоинерционность (задержка излучения после подачи тока меньше 0,1 мс) позволила обойтись без механической шторки. Исчезла необходимость в применении сине-голубого светофильтра. Фотоприемник 5 размещен посредине между светодиодами с той же самой стороны листка. Поэтому флуоресценция хлорофилла наблюдается "на отражение", что позволяет работать и с толстыми листьями растений. Чтобы сделать невозможным попадание на фотоприемник возбуждающего света от светодиодов, и для селекции слабых сигналов флуоресценции перед фотоприемником установлен красный светофильтр, а сам фотоприемник отделен непроницаемыми для света перегородками.

Фотография хронофлуорометра "Флоратест-2" [ [ 38 ] , [ 173 ] , [ 271 ] , [ 278 ] , [ 279 ] , [ 299 ] ] с открытой верхней крышкой показана на рис. 21.6. Здесь 1 и 2 – основа и крышка корпуса; 3 – матричный дисплей; 4 – кнопка включения прибора; 5 – кнопка выбора режима "меню"; 6 – кнопка ввода; 7 – кнопка "Пуск"; 8 – печатная плата с компонентами электрической схемы; 9 – выносная оптоэлектронная головка; 10 – разъем для ее подключения; 11 – внешний интерфейс USB; 12 – аккумуляторная батарея питания; 13 – разъем интерфейса. В его встроенной памяти можно накапливать множество данных измерений и потом передавать их в сеть связи или в персональный компьютер.

Рис. 21.6. Внешний вид хронофлуорометра "Флоратест-2"

Еще больше информации о фотосинтетическом процессе, физиологическом состоянии растения, о состоянии окружающей среды можно получить, наблюдая так называемую "модулированную" флуоресценцию хлорофилла [ [ 235 ] ].

Оптическая схема хронофлуорометра с модуляцией показана на рис. 21.7.

Рис. 21.7. Оптическая схема хронофлуорометра с модуляцией света: AL – источник неперервно "действующего" облучения; ML – источник слабого модулированного "измерительного" света; SP – источник импульсов "насыщающего" света; 1 – фотодетектор; 2 – светофильтр

Здесь: AL (actinic light) – источник непрерывного актиничного освещения с квантовой интенсивностью 20...500 мкмоль/(м²с), которое стимулирует и поддерживает процесс фотосинтеза в листке растения;

ML (measuring light) – источник слабого "измерительного" света, модулированного с частотой 2...600 кГц. Его квантовая интенсивность на поверхности листка 0,2...1 мкмоль/(м²с), которая на 2 порядка меньше интенсивности актиничного света, не вызывает существенных изменений состояния фотосинтетических систем, но позволяет проводить достаточно точные измерения. При этом выделяются, детектируются и измеряются только синхронные импульсные изменения интенсивности флуоресценции;

SP (saturation pulses) – вспышки "насыщающего" света продолжительностью 0,5...2 с с квантовой интенсивностью не менее 2000 мкмоль/(м²с), которые быстро закрывают (насыщают) практически все каналы оттока электронных возбуждений на фотосинтез. При этом энергия поглощенного света идет только на флуоресценцию или на тепловую диссипацию.

Источником непрерывно действующего света может быть и естественное внешнее освещение листьев растений, например, солнечное. Тогда процесс фотосинтеза исследуется в его естественном (стационарном) протекании. Источниками "измерительного" и "насыщающего" света управляет микрокомпьютер, входящий в состав модулируемого хронофлуорометра. Он включает и выключает их в соответствии с заданным пользователем алгоритмом, что предоставляет специалистам по физиологии растений широкие возможности для разнообразных исследований.

Если к описанной оптической схеме добавляют источник красного света, который активирует только фотосистемы І, то прибор позволяет нацелено изучать фотохимические процессы, которые происходят именно в этих фотосистемах. Еще больше информации можно получить, если вместо одного фотодетектора и светофильтра использовать два комплекта, каждый из которых измеряет свою спектральную составляющую флуоресценции.

Встроенный микрокомпьютер может не только управлять модуляцией излучения, включением/выключением дополнительных источников света, но и организовывать сложные эксперименты, например, с изменением температуры листочка, его увлажнением и т.д.