Спектрофотометрия в обратно рассеянном свете. Гемоглобиномеры и сенсоры кровенаполнения
Цель лекции: ознакомить слушателей с современными представлениями о процессах и закономерностях прохождения пучков света в человеческом теле, в частности, с закономерностями обратного рассеяния света. Четко сформулировать основные требования технологии спектрофотометрических измерений в обратно рассеянном свете. Объяснить принципы неинвазивных измерений абсолютной концентрации гемоглобина в тканях тела и разницу между средней концентрацией вещества в ткани и концентрацией того же вещества в крови человека. Раскрыть принцип неинвазивного измерения кровенаполнения тканей тела. Напомнить важнейшую роль микроциркуляторного русла крови в системе кровообращения человека и в жизнедеятельности всего организма. Показать возможности исследования этого русла и измерения его количественных характеристик, открываемые сенсорами кровенаполнения.
19.1. Анализ трудностей, возникающих при реализации неинвазивных спектрофотометрических сенсоров
В фотоплетизмографах, оксиметрах и пульсоксиметрах не шла речь об измерении абсолютных концентраций тех или других биохимически важных веществ в человеческом теле. А такая потребность часто возникает в медицине и биологии. Раньше в таких случаях на анализ обязательно брали пробу крови или образец ткани, соответствующим образом препарировали их и лишь после этого производили анализы. Но сейчас биологи и медики, как уже подчеркивалось, стремятся как можно больше информации получать без травмирования живой ткани, с наименьшим влиянием на естественные процессы. Но такие, неинвазивные измерения принципиально исключают предварительное препарирование, перевод объекта исследования в форму, наиболее удобную для измерений. И с этим связаны значительные технические трудности при разработке неинвазивных оптических сенсоров. Они вытекают из того, что:
- живые биологические ткани (далее – биоткани) имеют сложную клеточную микроструктуру, и поэтому оптически очень неоднородны; кроме поглощения, в них происходит значительное рассеяние света, которое варьирует при переходе от одного участка тела к другому, от одного человека к другому, что значительно усложняет задачи анализа;
- в биоткани, как правило, кроме вещества-аналита присутствует большое количество других биохимических веществ, создающих "фоновое" поглощение; от него бывает не просто отделить поглощение именно аналита;
- в человеческом теле мало участков, пригодных для измерений "на просвет", причем у разных людей такие участки (например, мочка уха, конечная фаланга пальца) имеют разную толщину, которая к тому же зависит от физиологического состояния и от сжатия. Поэтому более универсальной для неинвазивных измерений в живом теле была бы схема измерений "на отражение", когда для измерений используют обратно рассеянный телом свет;
- однако при работе "на отражение" значительную роль играет способ выделения измеряемого пучка света и оптический контакт между телом и прибором, которые могут значительно варьировать от одного измерения к другому;
- технология работы "на отражение" до 90-х г.г. ХХ века еще не была должным образом проработана.
Все эти трудности, по мнению некоторых специалистов, делают неинвазивные количественные спектрофотометрические измерения концентраций биологически важных веществ в человеческом теле якобы безнадежным делом.
19.1.1. Учет неконтролируемого рассеяния света
Однако не все так безнадежно, как это кажется скептикам. Начнем с проблемы выделения вклада именно поглощения при наличии рассеяния света. Усложним рассмотренную в "Спектрофотометрические сенсоры как один из видов оптических сенсоров. Фотоплетизмографы. Оксиметры и пульсоксиметры" (п. 18.1.2) классическую ситуацию с прохождением света сквозь плоскопараллельный слой раствора тем, что добавим в раствор вещество, которое не поглощает свет, но вызывает заметное его рассеяние ( рис. 19.1). Тогда при прохождении сквозь раствор свет ослабляется уже не только из-за поглощения молекулами красителя, но также и в результате рассеяния. Поэтому вместо формулы (18.8) имеем
 |
( 19.1) |
– коэффициент дополнительного ослабления света, обусловленного его рассеянием.
Рис. 19.1. Измерение концентрации красителя при наличии рассеяния света: слева – одноволновым, справа - двухволновым методом
Если значение не превышает во много раз значения 
, то, зная 
и измерив спектральные интенсивности 
, тоже можно определить концентрацию красителя.
Усложним ситуацию дальше. Пусть коэффициент рассеяния света Кsc нам не известен и может меняться от одного измерения к другому. Оказывается, что и это можно учесть, если вне основной полосы поглощения красителя существует такая длина волны 
, на которой рассеяние света такое же, как и на длине волны полосы поглощения 
. Тогда надо измерить спектральные интенсивности падающего и прошедшего сквозь кювету света на обеих длинах волны (
рис.
19.1 справа). Имеют место соотношения:
 |
( 19.2) |
 |
( 19.3) |
– спектральные интенсивности света, прошедшего сквозь раствор, и входящего в раствор, на длине волны ; 
– спектральные интенсивности света, прошедшего сквозь раствор, и входящего в раствор, на длине волны ; 
– пропускание кюветы на длине волны и соответственно; 
и 
– коэффициенты рассеяния света на длине волны и соответственно; 
и 
– молярные коэффициенты поглощения красителя на длине волны и соответственно.Если поделить выражение (19.2) на (19.3) и учесть, что 
, то получаем
![\frac{I_1}{I_2}=\frac{T_1I_{1,0}}{T_2I_{2,0}\exp[-(k_{mol}-k_{mol,2})cd].](/sites/default/files/tex_cache/f0b4336b4a16a0ad0def07eb6f703a8c.png) |
( 19.4) |
Это соотношение тоже позволяет определить концентрацию красителя в растворе, рассеивающем свет, по измеренным значениям 
и известным значениям 
. Таким образом, измерение спектральных интенсивностей на двух удачно подобранных длинах волны позволяет надёжно определять концентрацию вещества даже в условиях, когда рассеяние света раствором значительно и варьирует от измерения к измерению. Главное, чтобы эти вариации были одинаковыми в обоих рабочих спектральных интервалах.
19.1.2. Учет неконтролируемого фонового поглощения
Двухволновая схема измерения позволяет избавиться также и от влияния неконтролируемого фонового поглощения света другими веществами, присутствующими в растворе, при условии, что это фоновое поглощение слабее поглощения молекулами красителя и является приблизительно одинаковым на обеих длинах волны и . Теоретический расчет для обоснования этого приблизительно таков же, как и выше. Только, кроме коэффициента рассеяния , в формулах появляется слагаемое 
– коэффициент фонового поглощения. Если на длине волны он практически такой же, как и на длине волны , то от его влияния тоже можно избавиться, используя отношение спектральных интенсивностей. Результат измерения при этом почти не чувствителен к вариациям фонового поглощения, лишь бы только эти вариации были приблизительно одинаковыми в обоих рабочих спектральных интервалах.
Если излучение обеих спектральных компонент исходит из одного источника света, то двухволновая схема делает измерение практически нечувствительным к некоторым вариациям мощности излучения, лишь бы только спектральные интенсивности изменялись одинаково в обоих рабочих спектральных интервалах.
Если в исследуемом растворе присутствуют фоновые вещества, поглощение которых существенно отличается на двух выбранных длинах волны, тогда для определения концентрации аналита используют 3-волновой или многоволновой метод. Т.е. измеряют спектральные интенсивности света уже при трех или больше специально подобранных длинах волны с таким расчетом, чтобы фоновое поглощение можно было исключить путем соответствующих вычислений [ [ 272 ] , [ 281 ] ].