Принципы работы ППР-сенсоров. Промышленные ППР-сенсоры

Для обеспечения равномерного распределения интенсивности исходящего светового пучка по углам применена т.н. "интегрирующая сфера". Оптическая призма выполнена из сапфира с показателем преломления 1,76. Чувствительный элемент на стеклянной подложке с показателем преломления 1,51 оптически соединен с призмой через тонкий слой иммерсионной жидкости.

Ученые и разработчики из лаборатории микроинструментов и систем университета в Майне (The University of Maine, см. Интернет-страницу [http://www.umaine.edu/lasst/]) показали, что размеры ППР сенсора совсем не обязательно должны быть большими, как в BIACORE 3000. На рис. 23.10 слева показана в поперечном разрезе структура интегрального оптоэлектронного модуля MISL, изготовленного с применением микросистемных технологий, о которых рассказывалось в "Виды механических сенсоров. Представление о микросистемных технологиях. Деформационные сенсоры" .

Рис. 23.10. Чувствительный блок ППР сенсора, изготовленного с применением микросистемных технологий: слева – структура интегрального оптоэлектронного модуля; справа – блок в собранном виде. 1 – основа из кремния; 2 – поворотное зеркальце с опорой, приводом и схемой управления; 3 – линейка фотодетекторов со схемой усиления; 4 – прозрачная жидкость и стекло над ней; 5 – пленка золота; 6 –лиганд; 7 – частицы аналита; 8 – оптическое волокно; 9 – микролинза с микропризмой

На основе 1 из кремния сформировано плоское миниатюрное зеркало 2, которое под действием электростатических сил может в пределах 10-20 вращаться вокруг оси, закрепленной на его приводе. В рабочем слое кремния сформированы также линейка фотодетекторов 3 с микросхемами усиления и селекции сигналов и микросхема управления приводом зеркала. Над кремнием сформирован слой стекла, в котором над зеркалом 2 и фотодетекторами вытравлена полость, заполненная прозрачной жидкостью 4. На поверхность стекла нанесена тонкая пленка из золота 5, необходимая для наблюдения ППР. Поверх пленки 5 формируется рецепторный слой 6, чувствительный к частицам аналита 7. К интегральному оптоэлектронному модулю подведено оптическое волокно 8, возле торца которого установлены коллимационная микролинза и микропризма 9. Через оптическое волокно 8 на модуль поступает монохроматический поляризованный свет. Микролинза формирует из него параллельный световой пучок, который отклоняется микропризмой на нужный угол и падает на зеркало 2. От зеркала свет попадает на чувствительную поверхность сенсора, а после отражения от нее – на линейку фотодетекторов 3.

Справа на рис. 23.10 показан чувствительный блок ППР сенсора в собранном виде. Его размеры приблизительно 20x10x2 мм. Над чувствительной поверхностью интегрального модуля устанавливают проточную ячейку, через которую можно прокачивать растворы.

Для снятия кривой ППР микропроцессор включает источник поляризованного света. Свет по оптическому волокну 8 передается в интегральный модуль. С помощью микросхемы управления зеркалом 2 последнее устанавливается под заданным начальным углом. Микропроцессор считывает сигнал с фотодетектора, на который падает отраженный от чувствительной поверхности свет. Потом увеличивает на один шаг (например, на 0,05 ) угол наклона микрозеркала 2 и считывает из следующего фотодетектора интенсивность отраженного сигнала. После того как шаг за шагом будет снята вся кривая ППР, микропроцессор выключает источник света и вычисляет точное положение минимума ППР в данный момент времени. Через заданные интервалы времени измерения повторяются. Таким способом микропроцессор строит и выводит на экран сенсограмму процессов присоединения и диссоциации аналита, может вычислять параметры химической кинетики и концентрацию аналита в исследуемом растворе.

Большинство промышленных ППР сенсоров работает с угловой зависимостью интенсивности отраженных сигналов. Вариант наблюдения спектральной зависимости интенсивности отраженных сигналов длительное время не использовался, поскольку спектральные узлы с оптическими призмами или дифракционными решетками имели довольно значительные габариты. Но после того, как появились довольно компактные спектральные узлы типа Фурье-спектрометров и др., о которых речь уже шла в лекции 18, ситуация изменилась. И, например, американская фирма GWC Technologies выпустила в продажу ППР сенсор SPRimager II ( рис. 23.11), в котором используется инфракрасный Фурье-спектрометр. Резонансные кривые ППР наблюдаются в виде зависимости интенсивности отраженного света от волнового числа (см. рис. 23.3). Поскольку волновое число можно измерять с более высокой точностью, чем угол падения, то потенциально такой способ измерения является более чувствительным. Наилучшая разрешающая способность достигается в БИК свете с непрерывным спектром.

Сенсор спроектирован так, что в одной проточной ячейке может исследоваться одновременно целый массив разных проб. Образцы соответствующих "чипов" показаны на рис. 23.11 справа вверху. В них на стеклянной основе сформированы островки диаметром 0,75-1 мм из тонкой пленки золота, на которую осажден мономолекулярный слой протеина. С помощью микропипетки на каждый островок можно нанести микрокаплю (0,3-0,5 мкл) соответствующего раствора и иммобилизовать из него на слой протеина свой лиганд. Это позволяет исследовать взаимодействие одного и того же аналита с разными лигандами в идентичных условиях. Сенсор позволяет также в любой момент времени получить изображение одновременно всех исследуемых островков в отраженном под заданным углом поляризованном инфракрасном свете, т.е. в условиях наблюдения ППР ( рис. 23.11 справа внизу).

Рис. 23.11. Слева – измерительный блок ППР сенсора SPRimager II; справа вверху – стандартные основы групповых рецепторных "чипов"; справа внизу – пример ППР изображения группового чипа

На таком "ППР изображении" с одного взгляда видно, с какими лигандами связывается исследуемый аналит, а с какими не связывается совсем [http://www.gwctechnologies.com]. Можно исследовать также неравномерность связывания по поверхности сенсора и с течением времени. Полученные изображения могут сохраняться в компьютере для демонстраций и для дальнейшей обработки. Угол наблюдения можно изменять в пределах от 40 до 70 .

С помощью ППР сенсора SPRimager II в [ [ 109 ] ] появилась возможность, например, впервые наблюдать поверхностный плазмонный резонанс на тонких пленках оксидов металлов. Теоретически явление ППР можно наблюдать на поверхности любого проводника. Однако экспериментально его обнаруживали до сих пор на поверхности лишь благородных металлов. Использование в ППР исследованиях пленок оксидов металлов может значительно расширить область и возможности применения этого метода.

Широкое применение нашел ППР спектрометр, созданный в Институте физики полупроводников им. В.Е. Лашкарёва НАН Украины [ [ 126 ] , [ 174 ] , [ 267 ] , [ 311 ] , [ 312 ] , [ 326 ] , [ 328 ] ]. На рис. 23.12 показана одна из последних моделей этого спектрометра "Плазмон - 5".

Рис. 23.12. ППР спектрометр "Плазмон-5"

Прибор работает со сменными биочипами, на которые нанесена золотая пленка толщиной 45 нм. Источником монохроматического света (670 нм) служит GаАs лазер. Положение резонанса определяется путем точного механического поворота призмы в пределах 17 . Работой прибора управляет персональный компьютер, который также обрабатывает результаты измерений и выводит их на свой дисплей или на печать. Габариты прибора 220x125x95 мм, масса 2,8 кг.

Краткие итоги

Поверхностные плазмоны – это волны переменной плотности электрического заряда, которые могут возникать и распространяться в электронной плазме металла вдоль его поверхности или вдоль тонкой металлической пленки. Поверхностные плазмоны могут возбуждаться под воздействием поляризованного света, если проекция волнового вектора фотонов на плоскость металлической пленки равна волновому вектору поверхностного плазмона. При этом значительная часть энергии света превращается в энергию плазмонов, из-за чего интенсивность отраженного света резко падает. Это явление называют "поверхностным плазмонным резонансом". Если металлическая пленка 2 достаточно тонка, то значительная часть затухающей в металле электромагнитной волны достигает противоположной поверхности металла. И тогда ППР становится чувствительным к свойствам той среды, которая контактирует с металлом с противоположной стороны пленки. От электрической поляризации этой среды, в частности от её диэлектрической постоянной зависит положение минимума кривой ППР. Измеряя положение или сдвиг минимума, можно с большой точностью определять изменения этой диэлектрической постоянной или показателя преломления среды.

Выяснилось также, что, если на обратную сторону металлической пленки осадить тонкий "рецепторный" слой органических молекул, избирательно взаимодействующих с "аналитом", то ППР сенсор становится очень чувствительным к этому аналиту. По сдвигу кривой ППР можно определить концентрацию аналита и изучать кинетику его взаимодействия. Если в качестве рецепторного слоя используются объекты биологического происхождения, то такие сенсоры называют ППР биосенсорами. Различают две группы биорецепторных слоев: на основе природных ферментов и на основе антител. В последнем случае ППР сенсоры называют " ППР иммуносенсорами ".

Физическая разрешающая способность ППР сенсоров зависит от монохроматичности и размеров источника света, от параметров оптической схемы, от размеров отдельных фотодиодов в линейке фотоприемников. С помощью оптимальной математической обработки результатов многих измерений сдвиги кривой ППР можно определять с точностью на порядок больше физической разрешающей способности.

В настоящее время промышленностью выпускаются уже десятки марок интеллектуальных ППР сенсоров. Большинство из них рассчитаны на реализацию нескольких методик анализа, нуждаются в небольших объемах пробы. Некоторые имеют несколько каналов для одновременного сопоставительного анализа нескольких проб. У ряда сенсоров стандартные процедуры биохимических исследований в значительной мере автоматизированы. При использовании проточных ячеек эти процедуры включают такие этапы, как промывка буферным раствором, прокачка через ячейку заданного объема исследуемого раствора, измерения и запись сенсограммы, прокачка чистого растворителя, отмывание элюентом. Такие циклы могут автоматически повторяться несколько раз. С применением микросистемных технологий созданы также миниатюрные ППР сенсоры. А с применением Фурье-спектроскопии разработан интеллектуальный сенсор, в котором кривые ППР наблюдаются в виде зависимости интенсивности отраженного света от волнового числа. Работы по совершенствованию ППР сенсоров продолжаются.