Сенсоры с люминесцентными маркерами. Биолюминесцентные и сцинтилляционные сенсоры

22.2. Сенсоры с люминесцентными "маркерами"

В последнем десятилетии ХХ в. начались интенсивные разработки новой группы люминесцентных сенсоров. Они используют т.н. " люминесцентные маркеры " – специально синтезированные макромолекулы, в состав которых входят два важных функциональных звена ( рис. 22.2). Одно из них имеет выраженную люминесцентную активность, т.е. ярко светится под действием возбуждающего света (или иного возбуждающего фактора). Это звено называют сигнализатор (англ. reporter ). Другое звено делают выборочно чувствительным к аналиту – к тому химическому или биохимическому веществу, наличие которого надо обнаружить и определить его концентрацию. Это звено называют распознаватель (англ. recognition element ). Часто с этой целью используют молекулы естественных биохимических ферментов (энзимов). Но используют также и специально синтезированные молекулы-распознаватели.

Рис. 22.2. Функциональная схема люминесцентного маркера

В составе макромолекулы эти два звена взаимодействуют так, что, когда к распознавателю присоединяется частица контролируемого аналита, то это приводит к гашению или, наоборот, – к стимулированию люминесценции сигнализатора. И сенсор, измеряя интенсивность люминесценции, определяет по ее изменениям наличие и концентрацию аналита или характеристики специфического внешнего фактора.

При этом интеллектуальный сенсор, имеющий встроенный микрокомпьютер, обладает тем преимуществом, что легко может учесть нелинейность зависимости интенсивности люминесценции от концентрации аналита, а также влияние фактических изменений температуры, кислотности среды и других факторов, от которых (кроме концентрации аналита) тоже может зависеть интенсивность люминесценции. Наличие внутренней памяти позволяет такому сенсору отследить и сохранять в памяти динамику изменения интенсивности люминесценции, а следовательно, и концентрации аналита со временем. Микрокомпьютер может сделать из этого определенные диагностические выводы, рассчитать кинетические характеристики и сигнализировать о возникновении критических ситуаций.

Авторы работы [ [ 10 ] ] синтезировали, например, макромолекулы, в которых специфически чувствительное к молекулам воды звено ([Ru(phen)₂(dppz)]²⁺–1,10 phenanthroline и dipyrido [3,2- a:2',3'- c ]phenazine) присоединено к сигнализатору – политетрафлуороэтилену. Благодаря такому объединению, интенсивность флуоресценции последнего стала зависимой от относительной влажности окружающего воздуха. Люминесцентный сенсор с использованием этого маркера позволил измерять относительную влажность воздуха в диапазоне от 4 до 100 % (при 20 C) с воспроизводимостью лучше 4%. Однако при быстром изменении влажности требуется определенное время для установления нового динамического равновесия. Требуемое время составляет около 1,5 мин. Если пленку с такими макромолекулами-маркерами нанести ("иммобилизовать") на поверхность оптического волокна, то можно получить люминесцентный сенсор для измерения влажности грунта, зерна, сахара и т.п. материалов на заданных глубинах. Для этого зону оптического волокна с нанесенным люминесцентным маркером располагают в заданной точке внутри контролируемой среды (в грунте, в емкости с зерном, сахаром и т.п.). Через один торец в оптическое волокно вводят возбуждающий свет, который, достигая чувствительной поверхности, возбуждает в ней флуоресценцию. А на другом конце измеряют ее интенсивность. По результатам измерений микрокомпьютер вычисляет влажность контролируемой среды.

В работе [ [ 24 ] ] речь идет о синтезе макромолекулярного комплекса, выборочно чувствительного к атомам и ионам ртути. Люминесцентным сигнализатором в нем служит порфирин. Интенсивность его флуоресценции значительно возрастает после присоединения к комплексу атома ртути. Измерения проводят спустя 15 мин контакта с контролируемой средой. Люминесцентный сенсор с таким маркером имеет избирательную чувствительность к присутствию ртути порядка 25 мкг/л с воспроизводимостью 5-10%.

Еще один пример описан в [ [ 138 ] ]. Он касается быстрого обнаружения присутствия и измерения концентрации органофосфатов, которые входят в состав вредных для здоровья человека инсектицидов и ряда нейротоксинов. В биохимическом маркере для соответствующего люминесцентного сенсора звеном, селективно распознающим наличие органофосфатов, является фермент органофосфатгидролаза (organophosphate hydrolase – OPH), а люминесцирующим сигнализатором – карбоксинафтофлуоресцеин (carboxynaphthofluorescein – CNF). Люминесцентный сенсор с таким маркером обнаруживает наличие органофосфатов уже при концентрациях до 0,05 мкмоль/л. Количественное измерение концентрации, например, пароксона возможно в диапазоне концентраций от 1 до 800 мкмоль/л.

Научные сотрудники Центра флуоресцентной спектроскопии при университете штата Мериленд (США) разработали пластиковый глюкосенсор, который надо носить как контактную линзу в глазу (см. Интернет-страницу http://www.medline.ru/mednews/news.phtml?n=134). На периферию этого пластикового глюкосенсора нанесены специально синтезированные макромолекулы-маркеры, которые, взаимодействуя с молекулами глюкозы, становятся способны к флуоресценции. Если осветить этот сенсор синим или фиолетовым светом, то по интенсивности флуоресценции периферийной его части можно определить концентрацию глюкозы в глазной жидкости пациента. А это позволяет судить о средней за прошедшие сутки концентрации глюкозы в его крови.

Можно приводить еще много других примеров, совокупность которых свидетельствует о том, что сенсоры с " люминесцентными маркерами " могут иметь очень широкий спектр применений и действовать не хуже, чем высокочувствительные и высокоизбирательные естественные сенсоры, которые за миллиарды лет эволюции создала живая природа.

Некоторые исследователи даже разрабатывают на этом принципе "оптический нос" – интеллектуальный сенсор, который будет обнаруживать присутствие в окружающей среде одновременно десятков разных химических веществ и будет различать тысячи запахов (см., например [ [ 68 ] ]). Его основой будет набор (массив, "биочип" – рис. 22.3) из десятков или сотен чувствительных участков, на каждый из которых нанесены свои макромолекулы-маркеры какого-то конкретного химического вещества.

Рис. 22.3. Фотография "биочипа" с люминесцентными маркерами

Один чувствительный участок будет распознавать и позволит измерять, скажем, присутствие и концентрацию кислорода, другой – озона, третий – углекислоты, четвертый – аммиака, пятый – этилового спирта, шестой – метилового спирта и т.д. Распределение интенсивности флуоресценции по поверхности такого "биочипа" будет отображать "запах" – химический состав окружающей среды. Адресно измеряя интенсивность люминесценции каждого из таких участков и обрабатывая эти данные, микрокомпьютер может выдать информацию о наличии и концентрации всех десятков-сотен контролируемых химических веществ, неусыпно следить за составом газовой среды, давать интерпретацию характерных комбинаций "запахов", предупреждать об опасных ситуациях.

22.3. Биолюминесцентные сенсоры

Иной подход при создании люминесцентных сенсоров состоит в использовании собственной биолюминесценции живых организмов [ [ 145 ] ; http://www.modares.ac.ir/sci/saman_h/Pages/Bioluminescence%20; http://www.lifesci.ucsb.edu/~biolum/]. В природе обнаружены уже порядка тысячи биолюминесцирующих организмов, большинство из которых обитает в морях. На больших глубинах, куда уже не проникает внешний дневной свет, биолюминесценция оказывается чуть ли не единственным источником света и одним из главных средств коммуникации. Наземных самосветящихся организмов (бактерий, насекомых, "светлячков") намного меньше. Установлено, что за биолюминесценцию ответствен, как правило, белок люцифераза. Для свечения он использует энергию, выделяемую при окислении небольшой органической молекулы – люциферина. Люцифераза служит специфическим катализатором реакции его окисления, и часть освобождающейся при этом энергии излучает в виде биолюминесценции.

В 90-х гг. ХХ в. ученые стали активно заниматься созданием генно-инженерных конструкций для биолюминесцентных сенсоров. В основу таких конструкций чаще всего положена схема самозащиты клеток, выработанная за миллионы лет эволюции живых организмов ( рис. 22.4).

Рис. 22.4. Функциональная схема самозащиты живых клеток: 1 – токсины; 2 – распознаватель; 3 – репрессор; 4 – промотор; 5 – синтезатор; 6 – нейтрализатор

Если в живую клетку проникают "токсины" 1 – объекты, несущие угрозу нормальному функционированию клетки, – то там их ожидает белок-распознаватель 2, своего рода "сторож". Как только он "узнает" опасный токсин, то подает сигнал белку-репрессору 3, который до сих пор блокировал работу белка-промотора 4. Этот последний запускает в работу "синтезатор" – молекулу РНК, на которой синтезируются вещества 5, нейтрализующие токсины 1. Пока токсинов 1 нет, синтез этих веществ не нужен и потому блокируется, чтобы не расходовать понапрасну ресурсы клетки. Часто один и тот же белок одновременно является и распознавателем, и репрессором.

Для того, чтобы по такой схеме создать биолюминесцентный сенсор, в неё надо добавить биолюминесцирующий белок, например, люциферазу, а в качестве "синтезатора" использовать РНК, на которой синтезируются молекулы люциферина. Функциональная схема такого биолюминесцентного сенсора показана на рис. 22.5. Когда в окрестности распознавателя 2 появляются частицы аналита 1, на который "настроен" этот распознаватель, он связывается с такой частицей и сигнализирует об этом репрессору 3. Последний "освобождает" промотор 4, который запускает в "синтезаторе" 5 синтез люциферина. Появившиеся молекулы люциферина 6 в присутствии люциферазы 7 окисляются, и в результате высвобождающейся энергии возникает биолюминесценция. При отсутствии аналита синтез люциферина блокирован, и клетка не светится. Возможен и противоположный вариант: пока частиц аналита 1 нет, промотор 4 свободен, синтез люциферина идёт, и люциферин постоянно светится. Но как только частицы аналита появляются, распознаватель сигнализирует об этом репрессору, который блокирует работу промотора, синтез люциферина прекращается, и биолюминесценция исчезает.

Рис. 22.5. Функциональная схема биолюминесцентного сенсора: 1 – аналит; 2 – распознаватель; 3 – репрессор; 4 – промотор; 5 – синтезатор; 6 – люциферин; 7 – люцифераза

Сейчас уже отработана стандартная процедура создания генно-инженерных конструкций, обеспечивающих воспроизводство подобных биолюминесцентных клеток-сенсоров. Основой для них обычно служит плазмида бактерии Escherichia coli. В неё встраивают нужные дополнительные гены, взятые из ДНК соответствующих организмов. Реконструированную ДНК методами генной инженерии "запускают в работу" по производству закодированной в ней клетки. В результате появляется живая биолюминесцентная клетка с требуемыми свойствами. Затем созданные "бактерии-сенсоры" культивируют: наращивают в требуемых количествах в специальных питательных средах.

Например, в ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва) создали подобного рода биолюминесцентный сенсор, реагирующий на появление мышьяка. Ген для синтеза распознавателя мышьяка взяли у бактерии, у которой он имеется от природы. Люкс-ген взят от наземной светящейся бактерии — Photorhabdus luminescens, в ДНК которой участки, кодирующие синтез люциферазы и люциферина, расположены рядом, так что их удобно "вырезать". В этом же НИИ таким же методом генной инженерии созданы также биолюминесцентные сенсоры, распознающие присутствие солей тяжелых металлов, антибиотиков ампициллинового и тетрациклинового рядов, наличие гептила (ракетного топлива, которое вредно влияет на живые организмы) и т.д.

Интересной находкой стала реализация биолюминесцентного сенсора, который обнаруживает появление в организме веществ, посредством которых "согласуют" свои действия болезнетворные бактерии. Появление такого вещества означает, что в организме накопилось достаточно много бактерий, чтобы начать коллективную атаку на организм хозяина. По появлению этого вещества можно зафиксировать начало, "старт" инфекционного заболевания.

По существу каждую из произведенных с помощью генной инженерии специальных бактерий можно считать законченным биолюминесцентным сенсором. Ведь в ней есть (см. "От простых сенсоров - к интеллектуальным" ) и чувствительный элемент ("распознаватель"), и усилитель-селектор сигналов (репрессор, промотор и синтезатор), и сигнализатор (биолюминесцирующий белок). Однако этот микроскопический сенсор-клетка мало приспособлен для восприятия его сигналов людьми и макроскопическими приборами. Биолюминесценция отдельной белковой молекулы весьма слаба, и её очень трудно заметить на фоне других световых помех. Поэтому обычно используют большое количество (миллионы и миллиарды) таких бактерий. Но даже и их совместное свечение выделять из сторонних световых помех непросто, поскольку оно никак не модулировано. В этом отношении сенсоры с фотолюминесцентными маркерами имеют значительное преимущество. Ведь возбуждающее облучение в них можно специально модулировать, и точно так же будет модулирован и свет их фотолюминесценции. Благодаря этому слабую фотолюминесценцию можно выделить на фоне даже значительных, но не модулированных или по-иному модулированных помех.

Биолюминесцентный сенсор – это живая клетка. Поэтому в биолюминесцентных сенсорах надо обеспечивать условия для поддержания жизнедеятельности клеток. Люминесцентный маркер – это макромолекула, которая не требует жестких условий жизнеобеспечения. В этом тоже состоит преимущество сенсоров с люминесцентными маркерами. Зато живые клетки биолюминесцентных сенсоров легко размножать в питательных средах. В то время, как макромолекулы люминесцентных маркеров надо синтезировать искусственно.